2014年MikiYamaguchi等人通过基因重组技术生产了一种重组蛋白，主要用于体外检测癌细胞对mAb的内化效率，进而筛选出更有效的单克隆抗体。该蛋白包括一个没有受体结合域的白喉毒素diphtheria toxin (DT)和链球菌蛋白G(Streptococcus protein G)的C1、C2、C3 (3C)结构域，即DT3C。

　　DT3C是继Mab-ZAP之后检测细胞内化mAb效率的有效工具，文献数据显示，与mAb-Mab-ZAP相比，mAb-DT3C模拟的抗体偶联药物( Antibody-Drug Conjugate，ADC)具有易制备、分子量稳定及抗体内化效率高等特点[1]。

　　为了进一步验证DT3C在ADC抗体药内化效率检测中的作用，2015年，MikiYamaguchi等人又利用DT3C作为工具筛选了一种靶向胰腺导管腺癌细胞的anti-Mucin 13单克隆抗体[2]。

　　据不完全统计，目前DT3C作为检测mAb内化能力的工具已经用于近130项ADC药物mAb筛选专利中，那DT3C究竟是如何介导ADC药物mAb内化效率检测的呢?

什么是ADC药物内化?

　　在细说DT3C是如何介导ADC药物mAb内化效率检测之前，我们先来了解下什么是ADC药物mAb内化。

　　ADC药物由抗体、连接子和小分子毒素组成，是通过连接子(linker)将具有生物活性的小分子药物偶联至单克隆抗体上。单抗通过肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性定位到肿瘤细胞表面，并通过内吞/内化作用进入细胞，连接子在细胞内低pH值或溶酶体蛋白作用下断裂，释放出具有活性的细胞毒药物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，从而对肿瘤细胞起到杀伤作用。

　　该类药物利用抗体的特异性靶向运输药物分子到靶组织发挥作用，将细胞毒药物强大的细胞杀伤能力集中于肿瘤细胞，降低对正常组织的毒副作用。

　　在ADC设计研发过程中，首要的是药物靶点的选择。对于药物靶点的选择，除了要在肿瘤过度表达外，另一个重要因素是内吞/内化的效率，这是药物释放活性所必需的。抗体能否被内化主要由靶点决定，而抗体内化的效率则与抗原密度、抗体亲和力以及抗体与抗原结合表位密切相关。同一靶点的不同抗体也会表现出不同的内化效率。

DT3C如何介导ADC抗体药物内化效率体外检测?

　　如前所述，ADC药物中抗体能否被内化是药物效果评价的重要因素。这里你可能会疑问，ADC药物中抗体的内化与单纯的抗体药物内化有区别吗?为什么DT3C是专门针对的ADC药物呢?

　　首先，ADC药物中抗体的内化与单纯的抗体药物内化肯定是有区别，ADC药物的分子量是大于单纯的抗体药物的，相同条件下，二者的内化效率肯定是不一样的。

　　其次，DT3C替代的是ADC药物分子中的小分子药物，是一种免疫毒素，mAb-DT3C偶联物模拟的是ADC药物。

　　如下图所示：mAb-DT3C偶联复合物识别并结合细胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原复合物被内化;然后DT3C被胞质弗林蛋白酶(furin protease)切割，DT3C的催化结构域被释放到细胞质中。DT3C的催化结构域导致延伸因子(EF)-2的 ADP-核糖基化，随后通过抑制蛋白质翻译机制导致细胞毒性。

图1. Mechanism of antibody:DT3C-induced cytotoxicity

　　作为ADC药物抗体内化检测工具，DT3C优势可总结为以下三点：

　　第一，mAb-DT3C偶联物制备简单，仅在室温下孵育30min就能形成，而且在体外可以发挥患者给ADC药物后的功能;

　　第二，DT3C可与来自不同物种(如人、小鼠、兔、山羊)的任何 IgG 结合，形成 mAb-DT3C 偶联物，从而进一步扩大了DT3C作为mAb抗体内化检测工具的范围;

　　第三，只有当偶联物被靶细胞内化时，mAb-DT3C 偶联物才会显著降低细胞活力。

　　值得一提的是，在DT3C之前，Mab-ZAP是唯一能够检测细胞内化mAb 效率工具。Mab-ZAP由小鼠抗体和核糖体失活蛋白皂草素组成。当 mAb-Mab-ZAP 偶联物被细胞内化时，由于皂草素的毒性，细胞会发生凋亡。所以可以通过细胞的存活率来检测mAb是否被细胞内化。

　　但是，不能排除Mab-ZAP本身在一定程度上可能降低mAb内化效率，因为 Mab-ZAP是一种包含抗小鼠抗体的大分子。与Mab-ZAP相比，mAb-DT3C偶联物的分子量稳定且小于mAb-Mab-ZAP。并且，相关实验数据表明，mAb-DT3C内化效率高于mAb-Mab-ZAP。

来源：M. Yamaguchi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600–603

　　华美CUSABIO提供高纯度的DT3C蛋白(Code: CSB-EP360556CQR1)，助力ADC药物研发。

　　①可体外模拟ADC药物功能

　　②mAb-DT3C复合物制备简单

　　③可与多个来源的mAb结合

　　④抗体内化效率高于Mab-ZAP

ADC药物内化途径

　　目前，关于mAb-DT3C复合物内化的具体途径暂无相关文献报道。结合常规的ADC药物内化途径，一般来说，内化又称为内吞，正常的内吞作用可分为三个阶段：芽的形成、膜的弯曲和囊泡的成熟和膜的断裂并释放到细胞质中。

　　ADC药物内化途径可按是否依赖于网格蛋白分为：网格蛋白介导的内吞作用和非网格蛋白介导的内吞作用。

　　非网格蛋白介导的内吞作用又可进一步分为：小窝介导的内吞作用、小窝蛋白非依赖性载体蛋白/GPI-富集的早期内区室(CLIC/GEEC)和巨胞饮作用。

　　多种内吞途径有重叠的方面，因此内吞的过程一般是高度灵活和复杂的。这里以小窝介导的内吞作用为例：

　　网格蛋白介导的内吞作用(CME)包括几个连续和部分重叠的步骤。对于质膜上的一些受体而言，CME可以组成型发生;其他受体则需要配体或抗体结合后启动。当细胞质中的内吞衣壳蛋白开始聚集在质膜的内小叶上时，CME就开始了。衣壳蛋白通过从细胞质中招募并与额外的蛋白质接头并相互作用，继续组装和生长。关键的衔接蛋白使膜弯曲，从而将内化受体/配体集中到一个“网格蛋白包被坑”(CCP)中。在CCP颈部因CCP内陷变大而收缩的点处会通过断裂与质膜分离。肌动蛋白聚合有助于将CCP “向内”拉入细胞质，直到完全分裂，CCP 被释放并变成网格蛋白包被的囊泡 (CCV)。最后，CCV外壳解体，CCV与内体融合，分拣到确定的亚细胞位置，或者可以循环回细胞表面[3]。

　　近年来，研发人员致力于将 ADC 药物的应用扩展到其他疾病治疗领域，包括传染病和免疫相关疾病等。未来国内 ADC 药物市场规模也将十分巨大，在这一广阔市场前景的驱动下，国内大量医药企业进入到这一领域，并从这一领域取得突破。

华美生物跨膜蛋白系列产品助力新药开发

　　跨膜蛋白是目前最主要的药物靶点，占现阶段已知药物靶点的 60%以上，以跨膜蛋白为靶点的创新药研发一直是医药领域的研究热点。由于跨膜蛋白具有疏水亲脂的跨膜域，必须借助细胞膜的磷脂双分子层这一特殊环境来维持正确结构、保持生物活性，同时跨膜次数越多其具有的疏水亲脂跨膜区越多，在宿主细胞中表达水平越低、制备难度越大，因此体外制备有活性的跨膜蛋白是目前公认的技术难题。

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